mRNA疫苗相關產品-起發生物

一、mRNA疫苗生產可分為兩大塊：mRNA制備和脂質微粒進行包封

mRNA疫苗生產可分為兩大塊，可以類比為“原料藥"（mRNA）的生產和純化，以及“制劑"（利用脂質微粒進行包封）階段。原料藥（mRNA）生產涉及DNA原液制備和mRNA原液的制備，mRNA原液的制備（體外轉錄），是整個mRNA工藝流程中核心的步驟，而原料主要是酶。

(一)mRNA疫苗的生產

mRNA疫苗生產可分為兩大塊，原料藥（mRNA）的生產以及制劑（利用脂質微粒進行包封）階段。mRNA生產涉及DNA原液制備和mRNA原液的制備。所以mRNA疫苗的生產可分為三大階段，第一步DNA原液制備，第二步mRNA原液的制備，第三步是利用脂質微粒進行包封。

第一步：DNA模板生產，主要是質粒生產。編碼抗原的DNA模板生產，常用大腸桿菌大規模體內表達，最后提取和純化攜帶目的序列的質粒；

第二步：mRNA原液的制備轉錄，由DNA到mRNA。在無細胞的反應器內進行轉錄，通過T7、SP6或T3等RNA多聚酶作用，通過一步或者兩步法轉錄成為mRNA，同時加上5’的Cap及3’的PolyA尾巴，在進一步使用DNA酶將殘留的DNA模板進行消除；純化，使用離子交換等層析步驟進一步將轉錄形成的mRNA進行純化，進行超濾濃縮形成原液；

第三步：制劑階段，利用脂質微粒進行包封。通過微流體泵精確地控制著mRNA原液和脂質流速，將他們混合成脂質納米粒LNP。最后則是成品的灌裝及質量控制，貼簽形成終產品。

 二、mRNA合成過程所需原料

（一）國內外mRNAxin冠疫苗的合成工藝

BioNTech/輝瑞、Moderna和艾博生物mRNA疫苗的合成工藝如下：

1）BNT162b2–BioNTech/輝瑞

三核苷酸cap1類似物（（m27,3′-O）Gppp（m2'-O）ApG）（TriLink）和N1-甲基假尿苷-5′-三磷酸（m1ψTP）（ThermoFisherScientific）取代尿苷-5′-三磷酸（UTP）的存在下，通過T7RNA聚合酶對DNA進行純化和體外轉錄。

總結：轉錄采用一步法，帽子類似物作引物；甲基假尿苷取代尿苷。

2）mRNA-1273–Moderna

利用優化的T7RNA聚合酶介導的轉錄反應在體外合成了編碼序列優化的mRNA，尿苷被N1-甲基假尿苷wan全取代。轉錄后，使用牛痘苗封蓋酶（新英格蘭生物實驗室）和痘苗2′O-甲基轉移酶（新英格蘭生物實驗室）將Cap1結構添加到5’端。通過oligodT親和純化純化mRNA，通過切向流過濾將緩沖液交換到pH為5.0的醋酸鈉中，無菌過濾，并在-20°C下冷凍，直到進一步使用。

總結：轉錄采用兩步法，需要加帽酶的參與，甲基假尿苷取代尿苷。

3）ARCoV-艾博生物

該mRNA在體外使用T7RNA聚合酶介導的轉錄從質粒ABOP-028（GENEWIZ）的線性化DNA模板中產生，該質粒編碼SARS-CoV-2的密碼子優化RBD區域，并包含5’和3‘的未翻譯區域（UTR）和一條poly-a尾巴，以未修飾的NTP作為原料和T7聚合酶體外進行mRNA的合成，使用了牛痘加帽系統（VacciniaCappingSystem）(Novoprotein)進行加帽。

總結：轉錄采用兩步法，需要加帽酶的參與。

（二）mRNA制備過程原料

mRNA制備過程需要用到的主要原料包括質粒DNA模板、一系列酶（主要為7種酶）以及底物核苷酸等;

1、模板DNA所需原料：質粒

DNA模板生產，主要是質粒的生產。編碼抗原的DNA模板，通過質粒轉染到大腸桿菌大規模體內表達，最后提取和純化攜帶目的序列的質粒，即得到DNA模板。目前質粒的生產提取和純化工藝很成熟，可以自建生產線或者外包出去，例如輝瑞自建質粒生產工廠，大部分mRNA企業外包，Moderna和國內企業目前是外包。

制備mRNA質粒的要求：質粒用于制備mRNA，這類DNA本身不屬于API，DNA需要按照GMP規范進行，GMP質粒要求生產設備必須是專用的、符合GMP規范且配備潔凈間。

 2、mRNA體外轉錄所需原料：一系列酶+核苷酸底物

mRNA疫苗的研發與生產需要一系列酶的參與：mRNAT7聚合酶、無機焦磷酸酶、RnaseInhibitor、加帽酶以及2′O-甲基轉移酶、Poly(A)聚合酶和DNAase等主要7種酶。

如下表：

2.1轉錄過程所需要的酶

RNA聚合酶體系：RNA聚合酶是體外轉錄mRNA的關鍵酶。

T3、T7和SP6RNA聚合酶分別對T3、T7和SP6噬菌體啟動子具有高度的特異性。將目的基因序列克隆到T7和SP6啟動子下游的多克隆位點中，以克隆的DNA為模板體外合成相應的RNA。

T7RNAPolymerase（T7RNA聚合酶）【78MRNA-1104】高度特異識別T7啟動子序列，以含有T7啟動子序列的單鏈或雙鏈DNA為模板，以核甘酸（NTP）為底物，合成與啟動子下游的單鏈DNA互補的RNA。

無機焦磷酸酶【78MRNA-1109】：加入無機焦磷酸酶，增加RNA產量。無機焦磷酸酶（PPase）可催化無機焦磷酸鹽水解生成正磷酸鹽，可以為蛋白、RNA和DNA的生物合成反應提供動力，促進產物的生成。在工業化生產mRNA疫苗的時候會產生大量的無機焦磷酸鹽，為了保證mRNA疫苗高效生產，可以添加無機焦磷酸酶，可解除生成的無機焦磷酸鹽對反應體系的抑制。

RNase抑制劑【78MRNA-1103/78DA10001】：防止RNA的降解。少量RNase在RNA制備過程中引入，會導致RNA的降解，污染可能通過實驗過程中使用的槍頭、試管（離心管）和其他試劑引入。通常使用RNase抑制劑作為減少和控制此類污染物的預防措施。

RNase抑制劑能與RNaseA形成1:1復合體，抑制RNase活性，在mRNA疫苗研發和生產過程需要保持mRNA的穩定性以保證疫苗高質量的生產。

2、轉錄所需材料-核苷酸和修飾核苷酸

mRNA疫苗研發中常進行假尿嘧啶化修飾，尿嘧啶修飾是zui豐富的RNA修飾，一般由尿苷的異構化產生，mRNA的假尿嘧啶化修飾主要有三個功能：改變密碼子、增強轉錄本穩定性和應激反應應答。

3、加帽和加尾：共轉錄加帽/模板加尾，轉錄后加帽/加尾

真核生物體內會對轉錄形成的mRNA進行加帽，即在mRNA的5’端添加一個甲基化的鳥苷酸帽子（m7GPPPN結構），從而保護mRNA免遭核酸外切酶的攻擊以增加mRNA的穩定性，并且協助mRNA與核糖體的結合以促進翻譯起始。生物體內的帽子結構有cap0，cap1，cap2三種形式，牛痘病毒加帽酶能夠在mRNA的5’端添加cap0帽子，再使用甲基轉移酶處理即可得到cap1帽子。

此外，5'帽子還參加mRNA前體的剪接，參與mRNA3'末端多聚腺苷酸化，保證mRNA在細胞質中的穩定運輸。

加帽需要的酶：牛痘病毒加帽酶

可以將7-甲基鳥苷帽結構（m7Gppp，Cap0）加到RNA的5末端，大幅提高mRNA的穩定性和啟動mRNA的翻譯。牛痘病毒加帽酶能夠在一小時之內對mRNA進行加帽，效率接近100%。

在mRNA疫苗研發生產過程中，mRNA加帽效率和加帽mRNA穩定表達的效率對疫苗的工業化生產有重大的影響。牛痘病毒加帽酶體系加帽的mRNA在細胞內的表達效率大于帽子類似物mRNA的表達效率。

加尾酶：Poly(A)聚合酶

Poly(A)聚合酶可以催化ATP以AMP的形式依次摻入到RNA的3末端，即在RNA的3末端加多聚A尾。Poly(A)尾巴能夠增強mRNA的穩定性、提高翻譯起始效率、引導mRNA出核。

主要用到的酶：

1）牛痘病毒加帽酶【78MRNA-1105】：

2）痘苗2′O-甲基轉移酶【78MRNA-1106】

3）Poly(A)聚合酶

加帽酶非常昂貴，如何替代加帽酶？

一步法合成mRNA疫苗產品的加帽可以在mRNA的體外轉錄過程中通過摻入“帽子序列"實現，這種加帽技術會將加帽序列反向加在mRNA上，在反應體系中加入5’帽類似物，可以省一個加帽酶，以及減少純化步驟，一定程度上降低成本（尤其是節省了昂貴的加帽酶成本），但相對應地，產量較之兩步法（加帽酶參與）減少，因為加帽酶的加帽效率更高。

4、消除DNA模板：需要DNA酶【78MRNA-1110】

合成后的產物可能會有DNA殘留，在疫苗開發階段，殘留的去除是關鍵的步驟，以減少下游純化難度并增加產品的純度。需要用DNA酶（DNAase將殘留的DNA模板進行消除，在mRNA疫苗生產的過程中對DNA的殘留控制非常嚴格格。

二、關于遞送系統（LNP）原料

mRNA分子量大、親水性強，但自身的單鏈結構致使其極為不穩定，易被降解，自身攜帶負電荷，穿過表面同為負電荷的細胞膜遞送是難題，所以需要特殊的修飾或包裹遞送系統才能實現mRNA的胞內表達，遞送技術是mRNA公司的核心專li技術。

脂質納米顆粒（Lipidnanoparticle，LNP）是目前主流的遞送載體方式。由于其比較容易被抗原呈遞細胞吸收，因此最常被用于疫苗，目前三大mRNA疫苗ju頭企業，Moderna、CureVac和BioNTech xin冠疫苗均采用了LNP遞送技術。

此外還有陽離子脂質復合物(lipoplex，LPX)、脂質多聚復合物(lipopolyplex，LPP)、聚合物納米顆粒（Polymernanoparticles，PNP）、無機納米顆粒（Inorganicnanoparticles，INP）陽離子納米乳（Cationicnanoemulsion，CNE)，以及瑞博生物自主研發的GalNacN-乙酰半乳糖胺技術，能夠進行肝臟的定點傳遞。

 （一）LNP為主流的遞送載體方式

zui廣泛應用的LNP組成成分：聚乙二醇脂質、膽固醇、合成磷脂、可電離陽離子脂質、mRNA。目前上市的mRNA疫苗成分主要有以下5種：

1）mRNA；

2）陽離子脂質，與帶負電的mRNA結合，LNP最關鍵的成分；

3）膽固醇，介導LNP內吞，以及穩定LNP結構（膽固醇有助于增加細胞膜的流動性或硬度，加入膽固醇能提高納米顆粒的穩定性）；

4）磷脂酰膽堿，輔助型脂質，可以在內吞時加快mRNA的釋放；

5）聚乙二醇化磷脂，延長代謝時間，提高LNP穩定性。

 1、陽離子脂質體：LNP最關鍵的成分，是LNP逃離內體的關鍵成分

目前Moderna、輝瑞、BioNTech，Curevac，Acuitas，Genevant等公司都自行篩選或授權從其他公司購買的陽離子類脂質分子作為主要遞送材料，每家公司材料具體結構各不相同，但都屬于特定條件下戴正電荷的陽離子脂質。

陽離子脂質體開發，在遞送效率和細胞毒性之間平衡。可電離陽離子脂質作用是LNP遞送系統的關鍵，提高mRNA的體內穩定性，并幫助mRNA逃避溶酶體的降解。

在生產原液時，將mRNA和陽離子脂質體在特定PH值下混合一起，則陰離子mRNA就會和陽離子脂質體產生靜電吸引融合在一起，一旦LNP被細胞吸收，核內體的低pH環境將會融合LNP，從而釋放mRNA進入胞質溶膠。

陽離子脂質作為載體有著廣闊的應用前景，一些陽離子脂質會引起細胞毒性。陽離子脂質的細胞毒性取決于其親水性頭基的結構，含有季銨頭基的兩親分子比含有叔胺的兩親分子毒性更大。陽離子有細胞毒性，解決對人體的副反應是關鍵，可電離陽離子脂質是LNP技術的核心，也是專li保護的重點。

2、非陽離子脂質：膽固醇，介導LNP內吞，穩定LNP結構

膽固醇有利于確保LNP的雙層結構及脂質的流動性。中性脂質（如各種磷脂）也是用于構建LNP雙層結構的，因為陽離子脂質體的雙層結構并不穩定。

3、PEG-lipid：

PEG修飾的脂質體形成親水保護層，維持LNP空間的穩定性，聚乙二醇在顆粒表面可屏蔽血漿蛋白等成分結合顆粒，以避免LNP顆粒在體內被清除。

PEG-脂質結合物也可能引起不期望的毒性，含有PEG的LNP已知脂質結合物與免疫細胞相互作用，產生針對某些聚乙二醇化脂質的不希望出現的抗體。

4、磷脂酰膽堿，輔助型脂質，可以在內吞時加快mRNA的釋放。

5、其他賦形劑：有利于穩定pH、溫度等。

（二）LNP遞送系統專li壁壘

LNP遞送系統的核心壁壘其實是材料的專li。Arbutus公司在2009年持有的US8058069號專li和2015年在中國申請的CN1021192178專li對于核酸和陽離子脂質混合物進行了非常全面的保護，對于幾乎所有陽離子脂質和核酸和混合物，都進行了覆蓋，預計到2029年到期，到期之前專li保護難以撼動。

069核心專li內容：

包含一種或多種活性劑或治療劑的新型穩定脂質顆粒、制備脂質顆粒的方法和遞送和/或施用脂質顆粒的方法；更具體地，包含核酸(例如一種或多種干擾RNA)的穩定核酸-脂質顆粒(SNALP)、制備SNALP的方法和遞送和/或施用SNALP的方法；一種核酸-脂質顆粒，包括：

(a)核酸；

(b)占顆粒中總脂質的50mol%至65mol%的陽離子脂質；

(c)包含磷脂和膽固醇或其衍生物的混合物的非陽離子脂質，其中磷脂占顆粒中存在的總脂質的4mol%至10mol%，膽固醇或其衍生物占顆粒中存在的總脂質的30mol%至40mol%；

(d)抑制顆粒聚集的綴合脂質，其占顆粒中總脂質的0.5mol%至2mol%

（三）脂質包封過程所需原料

1、LNP遞送系統的關鍵原料:可離子化脂質、PEG脂質、DSPC脂質、膽固醇。

LNP直徑為80-100nm，每個脂質納米粒含有約100個mRNA分子。以ModernamRNA-1273疫苗為例：脂質壁由四種不同的化合物組成，

1）SM-102——專有陽離子脂質，是構成納米顆粒壁的基本結構

2）DSPC——磷脂酰膽堿，助力納米顆粒的壁結構

3）膽固醇——膽固醇存在于人體所有的細胞膜中，根據溫度的不同，膽固醇有助于增加細胞膜的流動性或硬度，加入膽固醇能提高納米顆粒的穩定性。

4）PEG-2000DMG——一種融于聚乙二醇的脂質，能幫助納米顆粒的形成。

專有陽離子脂質ALC-0315（輝瑞）和SM-102（Moderna）這兩種脂質都是叔胺，在低pH值下質子化（因此帶正電），在mRNA傳遞后實現安全清除。PEG脂質都是PEG-2000結合物。

LNP和mRNA的顆粒是通過自組裝形成，通過兩種液體按照適當的的流速和配比形成。基本原理：T型管一端是RNA的水溶液，一端是脂質的乙醇溶液，通過兩相的快速混合，從而讓LNP完成自主裝，需要控制水相和乙醇相的流速比，設計管道的形狀。

 脂質體的結構在很大程度上取決于它們的制備方法。脂質體可以是直徑20-100nm的單層（小的單層）囊泡（SUV），直徑為100-1000nm的大單層囊泡（LUV）-1000nm或直徑>1000nm的巨大單層囊泡（GUV）或直徑>500nm的多層囊泡（MLV）。藥物輸送系統主要使用SUV和小型MLV，而GUV主要用作細胞模型。粒徑是決定脂質體藥物包封率和循環半衰期的一個關鍵參數，較小的脂質體更有可能逃脫吞噬細胞的攝取。

脂質納米顆粒生產過程：LNP是在低pH（pH4.0）下制備的，此時可電離脂質帶正電荷，因此它很容易與每個脂質納米粒約100個mRNA分子形成復合物。微流控裝置用于將水中含有mRNA的流與乙醇中含有脂質混合物的流混合。當快速混合時，這兩種流的成分形成納米粒，將帶負電的mRNA包埋。

如何組裝LNP是mRNA疫苗生產最大的Know-how，需要控制LNP的組分、粒度、流量、流體形態等參數，來完成結構復雜的納米微粒組裝。目前從微流控到T型混合裝置核心技術掌握在極少數企業手中。

BioNTech/Pfizer xin冠疫苗的納米脂質體顆粒（LNPs）生產采用沖擊式射流混合法，，采用高壓泵，讓mRNA溶液和脂質體溶液形成兩股射流，在一個腔體中進行對沖，從而產生劇烈的湍流。這種湍流能讓LNP各個組分充分地混合，從而形成包裹mRNA的納米脂質體。

采用德國Knauer研發生產的IJM（碰撞噴射混合器）。規模化生產的沖擊式射流混合器結構和參數是根據Moerna、BioNTech等企業需求量身定制。